La historia gira entorno al conflicto entre dos "facciones" que pelean cada uno por sus ideales, los Templarios, que en apariencia son una de las muchas órdenes que luchan junto a los cristianos en la Tercera Cruzada, su objetivo es conseguir el llamado Fruto del Edén, con el cual pretenden apoderarse del espíritu y voluntad de todas las personas y así controlarlas. Su maestre es Roberto de Sable. Oponiéndose a ellos están los Asesinos o Hashsha-shin, cuyo objetivo es destruir a los Templarios para evitar que estos se apoderen del mundo, tienen su base en la fortaleza de Masyaf y su maestro es un sabio anciano llamado Al-Mualim. Al contrario que los templarios, los Assassins no tienen tantos recursos como estos y se ven obligados a "trabajar" de manera infiltrada para evitar llamar la atención de los Templarios.
La historia principal de Assassin's Creed se ubica en un futuro próximo, septiembre de 2012 d.C. Desmond Miles, un camarero, es secuestrado por desconocidos y es llevado a las instalaciones de Industrias Abstergo (una empresa farmacéutica cuya especialidad son los antidepresivos), donde investigadores trabajan en un proyecto con una máquina llamada "Animus". El "Animus" es capaz de extraer recuerdos del ADN del usuario, pasadas de descendiente a descendiente, permitiendo al usuario revivir estos recuerdos como si fuera él mismo. Desmond fue "elegido" para el proyecto debido a su relación con su ancestro Altaïr Ibn La-Ahad (النسر الطائر ابن واحد, el nombre significa en árabe "Águila que vuela" y el apellido "Hijo de nadie"), un miembro de los Hashsha-shin durante la Tercera Cruzada en Tierra Santa.